К еще одному профессиональному юбилею в 2023 году

Вспоминая тернистый путь формирования первой кафедры клинической лабораторной диагностики в системе Министерства Здравоохранения страны, 25 летие которой и приходится на 2023 год, можно вспомнить и поблагодарить многих соратников, причем не только штатных сотрудников Первого Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П.Павлова.

И это, прежде всего, Вадима Владимировича Меньшикова. Ведь после окончания 1го ЛМИ (Первого Ленинградского медицинского института) я принимал активное участие в формировании самостоятельного направления клинической медицины – нефрологии. Первостепенное значение на этом пути имела годичная стажировка в лаборатории основоположника фундаментальной нефрологии, в те годы секретаря-академика РАН, руководителя всего естественно-научного блока Российской академии наук, профессора Юрия Викторовича Наточина, к счастью, работающего и по сей день в Санкт-Петербурге в Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН. Кстати, основателя, а сегодня – декана медицинского факультета этого всемирно известного научного Центра, заложенного Петром Великим! В этом году Юрий Викторович был награжден Большой Золотой медалью РАН имени М.В.Ломоносова за фундаментальный вклад в изучение физиологии почки и водно-солевого обмена. Опираясь на достижения медицинской науки, инициативная группа в медицинском институте взялась за решение актуальной задачи практического здравоохранения многомиллионного города: создание специализированной нефрологической службы, отделения хронического гемодиализа и трансплантации почек. Именно это нефрологическое, заметьте, одно из самых лабораторно-емких направлений клинической медицины, привело меня на ул. Россолимо города Москвы, где располагалась кафедра и клиника, руководимая одним из основоположников клинической нефрологии, академиком Евгением Михайловичем Тареевым. Это ему принадлежат прозорливые слова о том, что «Особенно существенным я считаю знание врачом истинной ценности лабораторных исследований, правильная и глубокая интерпретация получаемых ответов.

Без этого даже прекрасно оборудованная лаборатория работает в какой-то степени впустую». Долгих и ярких, эмоциональных 10 лет увенчались построением всех конструкций системы и решением Правительства СССР о создании НИИ нефрологии в Санкт-Петербурге (все еще единственного в стране). Посещая клинику Е.М.Тареева, вероятно, не случайно, как то вечером, заглянул в находящийся там скромный коллектив Всероссийского Научно-методического и контрольного Центра по лабораторной диагностике, руководимый профессором В.В.Меньшиковым. На встречах «на высоком идейном уровне» - так мы шутили с Вадимом Владимировичем, поскольку Центр располагался, скорее, ютился, на верхних этажах здания, где обсуждались, действительно принципиальные вопросы развития отрасли, в том числе, в сфере подготовки кадров. К примеру, В.В.Меньшиков не сразу согласился обозначить миссию специальности в названии Всероссийского научного общества специалистов лабораторной медицины. Вадим Владимирович полностью разделял необходимость создания кафедр в медВУЗах как представителей целого направления медицинской, трансляционной, по сути, науки, формирующей у будущего врача лечебника компетенции по рациональному применению диагностических технологий современной лаборатории, приближающих к правильному диагнозу и, следовательно, более эффективному лечению (аксиома:…Хорошо лечит тот, кто хорошо диагностирует…). Сложности его взаимодействия с административно-партийным аппаратом Первого мединститута им. И.М.Сеченова и Правительством Москвы не позволили ему открыть такую кафедру с мед.ВУЗе. Это было ещё на заре создания «Национальных дней лабораторной медицины», когда мы ехали на огонёк к дружелюбным «тортилам» .- соратникам Вадима Владимировича: Гараниной Дилекторской, Т.И.Лукичевой, Е.М.Михайловой …. – они были самоотверженными героями невидимого фронта, победами которых мы пользуемся и по сей день: методический принцип «рождественского» приказа №380 (25.12.1997), многочисленными пособиями по стандартизации лабораторных технологий и пр. В.В. Меньшиков разделяя идею создания кафедры в медВУЗе, по существу, напутствовал, сформулировав в судьбоносном приказе принципиальное решение Министра Здравоохранения: «п.3. Управлению научных и образовательных медицинских учреждений:

—  Разработать унифицированные программы подготовки студентов медицинских институтов по специальности «Клиническая лабораторная диагностика».

—  Рассмотреть вопрос об организации в институтах кафедр клинической лабораторной диагностики для лечебных и педиатрических факультетов и подготовки кадров для них».

При встрече по разработке этого приказа, он и отметил, что новое дело требует смелых и грамотных первопроходцев, каким и представил мне М.Г.Залеского - скромного заведующего лабораторией санатория «Краинка», действительно, незаурядного учителя химии, к тому времени уже создавшего много новых технологических решений. Как то, в одной из неформальных встреч, за чашкой чая с пряниками, он и рассказал мне, что пряники привез «Тульский левша», как он образно отразил личность Михаила Григорьевича Залеского, который как то обратился в Научно-методический и контрольный Центр, всегда с тяжелой сумкой на плече, наполненной книгами. В те годы М.Г.Залеский заведовал лабораторией в санаторно-курортном комплексе «Краинка» Тульской области.    В те далёкие годы лаборатории практически не имели информативных технологий, обходились скромными «одноглазыми» микроскопами. Вот совершенствованию этого инструмента познания микромира и уделил свой талант пытливый изобретатель.

Петитом изложу любопытный материал, раскрывающий суть новых технологических решений диагностических задач с помощью микроскопа, разработанных М.Г.Залеским, которого отличает удивительная скрупулёзность, высокая ответственность, так необходимая специалистам «нашего цеха». Важно отметить, что в ограниченных условиях периферийного санатория, изобретатель сумел реализовать собственными руками эти новшества.

Изготовление самодельного окулярмикрометра для микроскопа из камеры Горяева (1984 г.).   

Окулярные микрометры (ОМ) используются для измерения микроскопических объектов. Большинство КДЛ не укомплектованы ОМ необходимыми при проведении паразитологических и цитологических исследований. Предлагаемый нами способ позволяет изготавливать ОМ в течение 30 минут. На скоростном наждачном круге камера Горяева обтачивается так, чтобы измерительная сетка оказалась в центре окружности диаметром         20 мм (рис.1). Изготовленный ОМ помещают в окуляр на подвижный столик счетной сеткой вниз и перемещают его, добиваясь четкого изображения сетки (рис.2). В качестве объективмикрометра используется тоже камера Горяева. Единицей измерения считается сторона маленького квадрата камеры Горяева в ОМ. При использовании окуляра х10 и объективов х8, х40 и х90 стороны малого квадрата окуляра соответственно равны 7,6; 1,5; 0,7 мкм. Что позволяет использовать ОМ для измерений исследуемых объектов при различной степени увеличений с высокой точностью, так как используемые ОМ и объективмикрометр сами являются стандартом точности. Точность не уступает окулярмикрометру ЛОМО.

     Рис. 1                                        Рис. 2

Размещение окулярмикрометра в в окуляре

Изменение угла наклона тубуса микроскопа (1987 г.).

Тубус микроскопа обычно жестко зафиксирован под определенным углом, как правило 45° к горизонтальной плоскости. Предлагается устройство позволяющее менять угол наклона тубуса микроскопа от горизонтального до вертикального положения. С монокулярной насадки микроскопа снимается тубус окуляра и на насадку с помощью переходного кольца крепится такая же монокулярная насадка с тубусом и окуляром. Взаимным вращением монокулярных насадок тубус с окуляром может занимать любое положение от горизонтального до вертикального удобное для наблюдателя. Для сохранения соразмерности получаемого изображения с стандартным микроскопом ЛОМО в предлагаемом микроскопе необходимо укоротить тубус. На данное устройство от кафедры клинической лабораторной диагностики РМАПО, получено экспертное заключение с рекомендацией обращение в фирму ЛОМО.

 

Фото предлагаемого микроскопа

Микроскоп с двумя тубусами для обучения (1986 г.).

Для обучения лаборантов работы с микропрепаратами обычные микроскопы неудобны. Обучающий и обучаемый не могут наблюдать микропрепарат одновременно. Предлагается устройство, позволяющее наблюдать микропрепарат одновременно двоим наблюдателям. На место монокулярной насадки на штатив ставится цилиндрическая приставка с такой же платформой для фиксации как и у монокулярной насадки. Внутри цилиндра закрепляется оптический клин, разделяющий поступающее в микроскоп изображение в двух направлениях: вертикальном и горизонтальном. Сбоку приставки по горизонтальной оси изображения в цилиндре сделано отверстие,     в котором на резьбе через переходное кольцо фиксируется стандартная монокулярная насадка с тубусом и окуляром. Сверху цилиндра фиксируется вторая такая же монокулярная насадка с тубусом и окуляром. Верхний тубус может вращаться на 360°. Таким образом, микроскопическое изображение может быть доступно двоим наблюдателям.

Микроскоп для двоих наблюдателей

Улучшение освещения препарата для микроскопирования (1987 г.).            

В обычном микроскопе рассеивающий светофильтр располагается под линзами конденсора (фиг.1), и значительная часть светового потока уходит за пределы собирающих линз. При использовании объектива с высокой степенью увеличения х90 для иммерсионного микроскопирования окрашенных мазков крови со стандартной электрической подсветкой не обеспечивает достаточного освещения препарата. Приходится сильно напрягать зрение.     После переноса рассеивающего светофильтра в специальную оправу (фото), над линзами конденсора (фиг.2), на поверхность предметного столика микроскопа, весь поток света от осветителя, попадающего на линзы конденсора фокусируется на поверхности исследуемого мазка крови в круге диаметром 3мм. Освещенность окрашенных форменных элементов улучшается и не требуется напрягать зрение при проведении микроскопирования препаратов с использованием иммерсионного объектива.

Предметный столик с оправой для матового стекла

Предложено и изготовлено электронное устройство, которое позволяет импульсно извлекать желудочное содержимое вакуум-установкой и исключает присасывание зонда к слизистой оболочке желудка. Прибор в 1985г. испытан на кафедре гастроэнтерологии Запорожского института усовершенствования врачей и рекомендован к внедрения в практику.

Изучая принцип, предложенный Михаилом Григорьевичем об изменении светового потока, невольно напрашивается мысль: может быть, продолжение изысканий повернет оптический луч внутрь исследователя?! Ведь глаз - часть мозга, возможно наделенного Душой и такое приспособление позволит увидеть и понять глубже самого себя? Вспоминаешь слова Ницше: если долго смотреть в бездну, то бездна начинает смотреть в тебя…. Такие мысли приводят к пониманию - Жизнь человека это мгновения, из которых складывается Вечность! Сегодня, оглядываясь вокруг, мы видим воплощение безграничного числа мыслей любознательных, талантливых предшественников, хотя и подчас простых, даже ленивых, людей (известный принцип развития: мы не ищем лёгких путей - нам лень), наконец, тех кто вдохновлял, просто по-житейски согревал, кормил, любил созидателей… Многие имена сформировали философский фундамент спирали развития цивилизации: Архимед, Сократ, Ньютон, Бор, Попов, Гегель, Эйнштейн, Менделеев…. создавали ступени, которые за ними, карабкались по «каменистым уступам». Подчас технологические новации, как паровая энергетика, электричество, атомные технологии, возмущали общественное спокойствие и приводили к глобальным переменам, но путь творческого поиска – императивен! Конечно, оставить след и наследить –далеко не одно и тоже, но и те, кто ничего не создал, спокойно прожил свой жизненный цикл, внес свою крупицу в апробацию новаций. Так, то, кто ломает - проверяет на прочность новации, стимулирует поиску новых решений!

Вернусь к временам общения с «отче наш» - В.В.Меньшиковым, в связи с компанией по присуждению премии его имени. В.В,Меньшиков прозорливо познакомил меня с М.Г.Залеским. В процессе все более тесного, хотя и дистанционного общения, отчетливо проявилась общность наших научных интересов. Напомню, что были годы, когда мы потеряли и то, что имели: краска Романовского, подчас, была дефицитом, а научные исследования требовали сложного оборудования, дорогостоящих реагентов…Поэтому на кафедре одним из научных направлений и стало не столько изучение состава биологических материалов основанных на сложных биохимических, иммунохимических исследованиях, сколько изучение биофизических свойств биологических объектов организма человека. Например, известен феномен резкого сгущения трахеобронхиального содержимого, известного нам, как «мокрота» у больных с бронхиальной астмой при воздействии причинно-значимого аллергена, что и приводит к обструктивному синдрому. Классика патологоанатомического описания вскрытия такого пациента: т.н. «виноградная гроздь» густой мокроты в просвете бронхов. Нами воспроизведен этот феномен in vitro: и при взаимодействии мокроты с причинно-значимым аллергеном, например, пыльцой определенного растения – изменяется не только вязкость мокроты, но и ее диэлектрические характеристики. У нас с Михаилом Григорьевичем, независимо вызвал интерес феномена С.Н.Шатохиной и В.Н.Шабалина – «Литос система». Механизмы т.н. «биокристалломики», т.е. патологического кристаллогенеза биологических кристаллоидных жидкостей изучал еще М.В.Ломоносов, но С.Н.Шатохина и В.Н.Шабалин. зарегистрировав открытие и ряд патентов на изобретения, сумели создать промышленный вариант диагностической тест-системы. Однако, биофизический механизм воспроизводимого, зарегистрированного Росздравнадзором медицинского изделия, оставался непонятным. На кафедре в серии, в том числе диссертационных работ, был изучен этот феномен как проявление модификации биофизических свойств биохимических пострансляционных изоформ уромодулина – уникального протеома системы мочеобразования. М.Г.Залеский, изучая тонкие механизмы процесса высыхания капли мочи, как фрагмент диагностического феномена, предложил гениальные по простоте методические подходы. Он наблюдал за движением воды при высыхании капли по движению пыльцы растений: от центра в периферии, затем нижние слои воды движутся к центру и, вновь поднимаясь на поверхность капли в центре, продолжают движение к периферии. Это, так называемое торообразное движение. А пространственное расположене биомаркера - альбумина, которое используют в тест-системе, М.Г.Залеский объективно зарегистрировал путем «крапления» альбумина обычным красителем: «синькой». Определение объема высохшей капли мочи. Эти наблюдения легли в основу успешно защищенной кандидатской диссертации на Совете при Всероссийском Центре радиационной и экстремальной медицины МЧС. Основные выводы: 1.Установлен научно обоснованный механизм процессов структуризации в высыхающих каплях мочи. 2.Литос–система определяет степень насыщенности мочи уромукоидами, которые являются обязательными компонентами при любом патологическом процессе почек, в т.ч. заболевании мочекаменной болезнью. Ниже, так же петитом оригинальные технологии, использованные в этой незаурядной диссертации.

                                                             Фация мочи с альбумином окрашенным метиленовым синим

Фация мочи без камнеобразования                Фации мочи с камнеобразованием

Фотосъемка микропрепаратов в микроскопе с помощью обычного фотоаппарата типа «мыльницы»

Фотоаппарат соединяется с тубусом бинокулярного микроскопа переходным кольцом. Через второй тубус с объективом устанавливается на микропрепарате объект фотографирования и производится фотографирование. Отцифрованные изображения препаратов легко можно передавать по электронной почте для консультаций.

Морфометрический способ измерения объема фации (Ф) биожидкости

Измерение толщины Ф биологической жидкости и расчёт ее объема важны для установления морфологического строения высыхающих капель различных биожидкостей – основы морфологии . Для установления объема Ф высыхающих капель был предложен следующий алгоритм:

Капля исследуемой биологической жидкости помещается на тонкий пластик – 50-100 мкм толщиной и высушивается в стандартных условиях. Острой бритвой Ф разрезается по диаметру пополам. Препарат помещается на предметный столик микроскопа при этом препарированная Ф оказывается сечением обращена к объективу. При малом увеличении - окуляр х7, объектив x10 с помощью окулярмикрометра производится измерение длины и высоты сечения Ф. Измерения высоты Ф проводилось через каждые 10 делений окулярмикрометра при данном увеличении. Учитывая, что в идеале Ф на поверхности подложки образует круг, используя известные математические формулы площади круга, объема цилиндра и тора, легко вычислить объем массы образующей краевую и центральную зоны, по результатам измерения сечения. Описанный способ, позволяющий измерить толщину Ф, определить объем и локальное распределение структурированного материала, защищен удостоверением на рационализаторское предложение № 1468 от 20.10.05. по СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова.

 Препарат для измерения объема фации

Способ получения документированного изображения фаций биожидкостей (2005 г.)

Нами был разработан способ получения документированного изображения Ф – пленок высохших капель методом получения их фотографического изображения без использования фотоаппарата и видеокамеры, переводимого в последствие в компьютерный формат. Тест-карта ДЛС или предметное стекло с находящимся на нем Ф биожидкости, диаметром 5-7 мм, помещается в канал обычного фотоувеличителя, и после получения четкого изображения на столике для печати производится экспонирование фотобумаги. Размер получаемого изображения Ф составляет 5-6 см в диаметре. Обработка фотобумаги производится стандартными проявителем и фиксажем для рентгеновской пленки в химических стаканчиках на 150 мл. После окончательной промывки, избыток влаги с поверхности фотобумаги удаляется бумажным полотенцем и высушивается в комнатных условиях. Полученное на фотобумаге изображение является негативным и после помещение в сканер инвертируется в черно-белом цвете в позитив. В результате получается документированное изображение Ф биологической жидкости в виде фотографии и в компьютерном формате. Предложенный способ документированного изображения Ф – пленок высохших капель биологических жидкостей, методом получения их фотографического изображения, без использования фотоаппарата и видеокамеры, переводимого в последствие в компьютерный формат защищен удостоверением на рационализаторское предложение № 1466 от 20.10.05. по СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова.

Негативное изображение фации на фотобумаге

Позитивное изображение фации после инвертирования                                                                                                       

Параллельно на кафедре различными биофизическими методами был описан механизм формирования изоформ уромодулина при его пострансляционном сиалировании. Это послужило основанием для М.Г.Залеского воспроизвести еще один феномен, описанный в ХV1 веке - Sedimentum lateritium (Sl), образование осадка в моче при ее охлаждении. В лабораторной модели Sl –холодовой пробе мочи (ХПМ) – охлаждении мочи до +4-5ºС, наряду с солевым осадком наблюдалось формирование гелеобразного осадка - криогеля. Оказалось, что криогель является уромодулином и процесс перехода из состояния золя в гель при охлаждении мочи отражает наличие его десиалированных изоформ, характерных для уролитиаза. Исследования, проведенные М.Г.Залеским у 4157 лиц общей популяции эффекта Sl, методом ХПМ позволило впервые установить:

1. Наличие в популяции эффекта образования криогеля (в 22,5%).

2. Наличие в гелеобразной субстанции - криогеле мочи олигомерной формы уромодулина с молекулярной массой 28х10⁶D.

3. Высокую частоту (94%) образования криогеля мочи при различных формах почечной патологии (патент №2402769 «Способ формирования групп риска с заболеванием почек». 2009 г.).

4. Всем известный эффект Sl, оказался важным диагностическим признаком патологических процессов в почках.

5. Предложенный метод ХПМ позволяет фиксировать появление молекулярных нарушений в моче, имеющих место на самых ранних доклинических стадиях развития патологических процессах в почках.

Сейчас на кафедре продолжаются исследования, начатые М.Г.Залеским, которые расширяют наши представления о механизмах метаболических повреждений канальцев почек при развитии хронической болезни почек и возможностях скрининга этих состояний в первичном звене здравоохранения. Однако, в повествовании о М.Г.Залеском, нужно вернуться к периоду, отражающего определенные черты личности. Тогда ПЦР технология, еще только начинала свое победоносное применение в КДЛ, а Михаил Григорьевич и здесь внес свою лепту, разработав технологию документирования результатов ПЦР диагностики, используя метод электрофореза в геле.

На столик обычного фотоувеличителя устанавливается трансиллюминатор, на который помещается планшетка с агарозным гелем после электрофореза. В канал держателя пленки фотоувеличителя вставляется отрезок фотопленки типа «Микрат». При включении ультрафиолетового трансиллюминатора на 15-30 секунд происходит экспонирование фотопленки в фотоувеличителе. Проявление, промывка, фиксирование и повторная промывка занимают 4 минуты. Негатив подсушивается бумажной салфеткой и в течение 1 минуты высушивается бытовым феном. Пленка вставляется в канал в обычного диапроектора и проецируется на экран. Все это занимает 5-6 минут. В результате устраняется элемент субъективизма в оценке результатов ПЦР, в наличии есть объективный документ о проведенном исследовании.

Результаты ПЦР анализа после электрофореза на агарозном геле

Предложенное М.Г.Залеским в те далекие годы технологическое решение по повышению объективности, следовательно, достоверности лабораторного исследования, полностью соответствует его характеру и жизненной, гражданской позиции. Многие годы коллектив санатория выдвигал Михаила Григорьевича быть их профсоюзным защитником. Это было тяжелым испытанием в период хаотичной приватизации, отсутствия у государства возможности уделять санаторно-курортному лечению должного внимания, когда в приоритетных направлениях: скорой помощи, первичном звене были огромные проблемы. Примером, принципиальности, явилась и история его обращения в Минздрав СССР в 1988 году. Михаил Григорьевич отметил ошибку в приказе Минздрава СССР от 21.11.1979г . №1175 в котором при описании диагностики алкаптонурии (редком наследственном нарушении обмена веществ) в п. 3.9.8. «Обнаружение гомогентизиновой кислоты (ГК)» констатировано, что после добавления щелочи моча окрашивается в синий цвет. Однако, для обнаружения в моче ГК известно два метода: в одном, в мочу добавляется раствор щелочи и моча окрашивается в темно-коричневый или черный цвет, а в другом, в мочу добавляется молибденовый реактив с азотной кислотой и фосфат калия и моча окрашивается в синий цвет. Т.е. в приказе МЗ СССР условия реакции взяты из одной методики, а результат из другой! Кстати, ошибка до сих пор не исправлена и, к сожалению, присутствует в современных руководствах по исследованию мочи. Обращение директора института медицинской генетики, вице-президента Российской Академии медицинских наук, академика РАМН Николая Павловича Бочкова, по просьбе Залеского М.Г. в Минздрав СССР тоже не дало результатов.

Итак, лабораторная медицина сформировалась от прозорливого эмпирического наблюдения органолептических свойств мочи и достигла фантастических высот, подчас превосходя по смелости искусства корифеев клинической медицины! Например, лабораторный «Троянский конь» - аденовирусный «проводник» в логово полчищ опухолевых клеток; наночастицы графена и флюорена, действующие как невидимки, проводят коррекцию на генетическом уровне воздействуя на рецептурный аппарат клетки… Но успехи зависят, прежде всего, от кадров – их компетенции и гражданской позиции. (Кадры, как известно, «решают все»!)

Представляя Михаила Григорьевича Залеского (в год его 75 летия) к присуждению премии имени В.В.Меньшикова, совместно с Еленой Евгеньевной Половинкиной, многие годы исполняющей обязанности главного специалиста по клинической лабораторной диагностике Тульской области, на себе испытавшей напор активного члена профессионального сообщества, смелого и, главное грамотного специалиста, готового преодолевать непробиваемые «ватные стены» чиновничего безразличия и быть добрым наставником молодых специалистов, любознательным исследователем - истинным последователем В.В.Меньшикова.